制備型(xing)超高(gao)速離心機的(de)幾(ji)種分(fen)離方法：

    A．差速離心：逐次(ci)增加(jia)離心力(li)，每次(ci)可沉降樣(yang)品溶液(ye)中的(de)一些組(zu)份。

    差速離(li)(li)心是一(yi)種常用(yong)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)。在這種方(fang)法(fa)(fa)中，離(li)(li)心管在開始時裝滿了均一(yi)的(de)(de)(de)樣品(pin)溶(rong)液(ye)。通過在一(yi)定(ding)速度下一(yi)定(ding)時間的(de)(de)(de)離(li)(li)心后(hou)，就(jiu)可得到兩個(ge)部(bu)份：沉淀和上(shang)清(qing)液(ye)。

    通常在*次離(li)心(xin)(xin)時(shi)把(ba)大部分不(bu)需要(yao)(yao)的(de)(de)大粒子(zi)(zi)沉降(jiang)去掉。這時(shi)所(suo)(suo)(suo)需的(de)(de)組(zu)份(fen)大部分仍留在上(shang)清(qing)液(ye)中。然(ran)后(hou)將收集(ji)到(dao)(dao)的(de)(de)上(shang)清(qing)液(ye)以(yi)更高速(su)度離(li)心(xin)(xin)，把(ba)所(suo)(suo)(suo)需的(de)(de)粒子(zi)(zi)沉積下(xia)來。離(li)心(xin)(xin)的(de)(de)時(shi)間要(yao)(yao)選擇得當，使大部份(fen)不(bu)需要(yao)(yao)的(de)(de)更小的(de)(de)粒子(zi)(zi)仍留在上(shang)清(qing)液(ye)中。對于得到(dao)(dao)的(de)(de)沉淀(dian)和上(shang)清(qing)液(ye)可以(yi)進行進一步的(de)(de)離(li)心(xin)(xin)，直(zhi)到(dao)(dao)達到(dao)(dao)所(suo)(suo)(suo)需要(yao)(yao)的(de)(de)分離(li)純度為(wei)止(zhi)。

    差速離(li)心的(de)特點是操作簡單，但分離(li)純度(du)不高。

    B．密(mi)度(du)(du)梯度(du)(du)離心法：可以同時使樣品中幾個或(huo)全部(bu)組份分離，具有很好的分辨率(lv)。

    (1)速率區帶(dai)法(ratezonal)：

    根據(ju)樣品中不同(tong)粒子(zi)所(suo)具有的不同(tong)的尺寸(cun)大小及沉降速度(S)。大致(zhi)步驟如下：

    在(zai)離心管中裝(zhuang)入密度(du)梯度(du)溶(rong)液(ye)，溶(rong)液(ye)的密度(du)從(cong)離心管頂部底部逐漸增加(正(zheng)梯度(du))。

    將所需(xu)分(fen)離的(de)樣(yang)品小心地加(jia)密度(du)(du)梯度(du)(du)溶液(ye)的(de)頂(ding)部。樣(yang)品在梯度(du)(du)溶液(ye)表(biao)面形成一(yi)負梯度(du)(du)。

    由于不同大小的(de)粒(li)子在(zai)離(li)心力作(zuo)用下，在(zai)梯度中(zhong)移動(dong)的(de)速(su)度不一(yi)樣，所以經(jing)過離(li)心后會形成幾條分開的(de)樣品區帶。

    注(zhu)意：樣品粒(li)子的密(mi)度必須(xu)大于梯度液注(zhu)中(zhong)任一點的密(mi)度。離(li)心過(guo)程必須(xu)在(zai)區帶(dai)到達管子底部前停止。

    (2)等密度離心法(isopycnic)：

    根據粒子(zi)的不同(tong)密(mi)度來分離(li)。離(li)心過程中，粒子(zi)會(hui)移(yi)與它(ta)本身(shen)密(mi)度相同(tong)的地方形成區帶。

    密(mi)(mi)度(du)樣度(du)的(de)選擇要(yao)使梯(ti)度(du)的(de)范圍包括所有待分離粒(li)子的(de)密(mi)(mi)度(du)。樣品可以在密(mi)(mi)度(du)梯(ti)度(du)液粒(li)上面或(huo)均勻分布在密(mi)(mi)度(du)梯(ti)度(du)中(zhong)。經離心后(hou)，樣品粒(li)子達到它(ta)們的(de)平衡點。

    注意：平衡后粒子的分離(li)*由其(qi)密度(du)決定，與時間無(wu)關(guan)，此時再改(gai)變離(li)心轉速，只(zhi)能改(gai)變區帶的相對位(wei)置。

    密度梯度分析法

    (1)梯度介質性質與選擇：

    A、應具備的性質：

    梯度物質的(de)選擇原則是(shi)滿足分(fen)離方(fang)法的(de)基本要求，一(yi)個理(li)想的(de)密度材料(liao)標準它應是(shi)：

    所形(xing)成的溶液(ye)密度應包括所需要的密度范圍。

    具有某些性(xing)質，如(ru)折射率(lv)，據此可測定它的濃度。

    所形成的溶液粘度低。

    不損(sun)傷所分離(li)的樣品。

離心(xin)分離后容易除去。

    不(bu)妨礙分(fen)離積分(fen)的分(fen)析。

    B、常用介(jie)質種類(lei)：

    表(biao)一(yi)、常用梯度(du)材料在(zai)20℃密度(du)

    B．梯度(du)介質應用范圍：

    表二、等密度梯度介質(zhi)的應用

    表三、各種大分子在蔗糖梯度液中(zhong)的大約密(mi)度

    (2)、梯度溶液的準備：

    計算,稀釋(shi)

    (3)梯(ti)度形狀

    梯度形狀分(fen)：線型(xing)、等速型(xing)、階梯型(xing)、平坦型(xing)、陡峭(qiao)型(xing)指數梯度。

    梯度形狀對于分離是(shi)否成功(gong)非常(chang)重(zhong)要：

    常用(yong)的是線型(xing)梯度，適用(yong)于分(fen)離蛋(dan)白(bai)質、酶、激素、核糖體(ti)亞(ya)(ya)基(ji)和(he)一(yi)(yi)些植(zhi)物(wu)病毒；等速(su)(su)型(xing)適用(yong)于分(fen)離脂(zhi)蛋(dan)白(bai)和(he)一(yi)(yi)些需上浮分(fen)離樣(yang)品；不連續或階梯型(xing)梯度適用(yong)于分(fen)離整細(xi)胞(bao)、亞(ya)(ya)細(xi)胞(bao)組分(fen)以(yi)及純化一(yi)(yi)些哺乳(ru)類動物(wu)病毒或昆(kun)蟲病毒。等速(su)(su)梯度以(yi)及長液柱(zhu)可(ke)增進(jin)分(fen)離能力，適用(yong)于分(fen)離核糖體(ti)亞(ya)(ya)基(ji)、多核糖體(ti)及植(zhi)物(wu)病毒。

    B．梯(ti)度柱制備：

    梯(ti)度液柱可以(yi)用手工或梯(ti)度儀制(zhi)備

    半注(zhu)法：

    為縮減(jian)離(li)心時間(jian)，或(huo)分離(li)樣(yang)品(pin)較少可用半注(zhu)法：下半管鋪置梯度(du)介質，中間(jian)加樣(yang)品(pin)，上面鋪Buffer或(huo)液體石臘油。

    (4)加樣(yang)方(fang)法與(yu)加樣(yang)量：

    將樣(yang)品(pin)(pin)加(jia)到梯度(du)液柱(zhu)上，針尖(jian)和離心管成45-60°角度(du)，慢慢地(di)將樣(yang)品(pin)(pin)沿管壁流到液面上去，對(dui)于DNA一類易(yi)斷的脆(cui)弱樣(yang)品(pin)(pin)，應該用(yong)孔徑(jing)較大(da)的移液管代替(ti)針頭，以避(bi)免剪切力對(dui)樣(yang)品(pin)(pin)的切割作用(yong)。樣(yang)品(pin)(pin)濃度(du)是梯度(du)柱(zhu)小密度(du)的1/10(W/W)。

    (5)轉子的選擇與效(xiao)應：

    (6)分離區帶的(de)回收及檢(jian)測

    離心后所(suo)形(xing)成的區帶樣品的回收(shou)方法基本有四種：

    a.穿刺(ci)法

    穿刺(ci)離心(xin)管底部，使梯(ti)度溶液滴(di)出，將(jiang)一具有合適閥門的蓋帽放(fang)在離心(xin)管頂，可控制(zhi)滴(di)出速度。

    b.虹吸法：

    將一(yi)毛細(xi)管(guan)輕輕插入管(guan)底，盡(jin)量(liang)(liang)防(fang)止梯(ti)度(du)抖動，用微量(liang)(liang)泵逐漸滴取，以一(yi)定量(liang)(liang)滴數(shu)或體積(ji)部分收取。

    c.加壓(ya)法：

    通過一(yi)針管將高密度(du)的(de)液體泵入到梯度(du)離心管的(de)底部，部分收集換出(chu)的(de)溶(rong)液。

    d.切割法(fa)：

    采用的切割(ge)刀切割(ge)所需區帶。

區帶檢測：

    所謂區帶檢測，實際上是對水平轉(zhuan)子或角轉(zhuan)子和垂直轉(zhuan)子離(li)(li)心管(guan)中的(de)(de)分(fen)離(li)(li)物質(zhi)所做的(de)(de)監測，通常只是測量在260或280mm時(shi)長的(de)(de)吸收值，以決定梯度(du)中的(de)(de)或蛋白的(de)(de)整個分(fen)布，這個操作(zuo)通常稱之為在線(online)監測。